岩手医科大学 先端医療研究センター 中間報告書(各テーマ用)
|
プロジェクトカテゴリー (該当するものを選んでください) |
老年疾患克服に向けた探索的医療プロジェクト 1. 老年疾患の遺伝子要因と環境要因の交絡に関する疫学研究
|
|
研究プロジェクト名 |
ゲノム遺伝情報の維持機構としての塩基除去修復反応系の生化学的解析 |
||
|
研究代表者 |
久保田美子 |
所属 |
生化学講座 |
|
共同研究者 |
高浪タカ子,堀井高文,徳永高也,丸山盛貴,片倉(今泉)典子,清水新司 |
|
|
キーワード（日本語）
|
酸化損傷 |
ゲノムの安定性 |
罹がん傾向 |
|
|
Key Words (English)
|
Oxidative damage |
Genomic stability |
Cancer susceptibility |
|
DNA repair |
|
|
【背景】
ゲノムDNAは細胞の生存に必要な遺伝情報を保持する生体高分子化合物であり,その安定的な維持が細胞の正常な成長,増殖,生存に必須である.ところが,他の生体分子と同様にゲノムDNAも生体内において様々な化学修飾を受けている.特に酸化はDNA分子にとっても大きな影響を及ぼす化学変化であり,ほ乳類細胞に一日あたり数千個生じているという報告もある.さらに,アルキル化や脱アミノ化,脱塩基なども数千個以上生じているという.これらのDNA損傷が修復されず残されれば,正確な遺伝情報は失われ,細胞の老化,がん化,細胞死を引き起こすと考えられている.XRCC1タンパク質は,酸化,アルキル化,脱アミノ化,脱塩基などのDNA損傷を修復する反応経路に関与している様々な酵素と相互作用し,DNA修復を促進する機能がある.XRCC1の欠損に起因する疾患は現在までに報告はないが,XRCC1の多型とがんの罹患傾向については盛んに疫学的解析が行われている.
【目的】
我々は,XRCC1の機能を解析することによってDNA修復効率の低下と細胞の老化,がん化,細胞死の分子機構の関連について解析を進めることを大きな目標としている.具体的に本オープンリサーチプロジェクトとしては,１）ヒト集団中に存在するXRCC1の多型が実際DNA修復効率に影響を与えているのかを解析すること,２）XRCC1と相互作用する新規のタンパク質を検索し,この相互作用によるXRCC1のこれまで知られていなかった機能を明らかにすることの２点を目標とした.
【方法】
１）XRCC1の多型には,アミノ酸置換を伴うものがいくつか知られている.このうち,この存在が最初に報告された３カ所の多型について,ヒトXRCC1 cDNAに部位特異的変異を導入して多型タンパク質を発現させるベクターを作成し,XRCC1欠損細胞に導入して構成的発現細胞株をを複数得た.これらの細胞株のアルキル化剤 methyl methansulfonateによるDNA損傷に対する感受性をコロニー形成能によって,さらにDNA修復kineticsをアルカリコメット法によって,それぞれ定量した.２）XRCC1に相互作用する新規のタンパク質を,ヒトtestis cDNA libraryを用いて酵母2ハイブリッド法によって検索した.
【結果】
１）多型XRCC1を構成的発現する細胞株についてDNA損傷に対する感受性,DNA損傷を修復する活性を定量したところ,野生型とくらべてDNA損傷に対して高い感受性を示し,DNA修復活性も低下している多型を見出した.得られた細胞株について,その多型XRCC1タンパク質がなぜDNA修復活性が低下しているのかを調べるため,XRCC1の細胞内局在を解析した.この結果,XRCC1は細胞核にドット状に存在し,DNA損傷が生じるとそのドット状の局在が強くなることが分かった.一方,DNA修復活性が低下している多型XRCC1はDNA損傷が生じても,強いドット状の局在を示さなかった. ２）XRCC1と相互作用するタンパク質としてクロマチンリモデリングに関与しているタンパク質が新規に同定された.
【考察と展望】
これまでXRCC1の多型と罹がん傾向との関連が,疫学的調査によって非常に多く報告されている.この中には,あるXRCC1の多型と有意に罹がん傾向が見られたとの報告も多くあるが,一方で,同一の多型について関連は無いという反対の結果が導かれている報告もある.これは調査対象の遺伝的背景,生活習慣等の違いが関係していると考えられる.我々は,このような背景の違いによって見えにくくなっている差異を検出するためには同一の遺伝背景を持った培養細胞を用いた実験によって多型タンパク質の機能を定量することが必須であると考えた.その結果,これまで遺伝子頻度が比較的低かったために疫学的調査のあまり行われていなかったArg280His多型に機能の低下があることが明らかになった. 我々のこの培養細胞を用いた実験を支持するデータが米国の疫学調査から出されていることから,日本におけるこの多型の頻度の解析などが今後行われることを期待している.
また,XRCC1タンパク質はタンパク質間の相互作用に関係するBRCT motifを二つ有しており,DNA修復に関与するタンパク質と相互作用することが報告されている.XRCC1はこの相互作用によってDNA修復を速やかに進めるためのback boneのような働きをしていると考えられているが,我々はXRCC1にはDNA修復のみによらず,他の機能によってDNA損傷に対する抵抗性を担っている可能性を示す結果を得ている.まだ明らかになっていないXRCC1の機能を知るために新規の相互作用タンパク質を検索し,同定した.現在この相互作用の性質について免疫沈降,ゲル濾過などの方法で解析している.さらに,この相互作用の意義を調べるため,相手タンパク質をsiRNAによって発現を抑制し,その細胞がDNA損傷に対して感受性を示すかを解析しようとしている.XRCC1の機能を明らかにすることによって,その多型タンパク質の機能低下が細胞にとってどのような影響を及ぼすのか正しく理解できると期待している.
参考論文
1) Ladiges W C: Mouse models of XRCC1 DNA repair polymorphisms and cancer. Oncogene 25:1612-1619, 2006
2) Kubota Y., Horiuchi S: Independent roles of XRCC1’s two BRCT motifs in recovery from methylation damage. DNA Repair, 2:407-415, 2003
発表業績
1) Takanami T, Nakamura J, Kubota Y, Horiuchi S: The Arg280His Polymorphism in X-ray Repair Cross-Complementing Gene 1 Impairs DNA Repair Ability. Mutation Res. 582:135-145, 2005
2) Pachkowski B F, Winkel S, Kubota Y, Swenberg J, Millikan R C, Nakamura J: XRCC1 Genotype and Breast Cancer: Functional Studies and Epidemiologic Data Show Interactions between XRCC1 Codon 280 His and Smoking. Cancer Res. 66 (5) 2860-2868,2006
3) Koyama A, Kubota Y, Shimamura T, Horiuchi S: Possible association of the X-ray cross complementing gene 1 (XRCC1) Arg280His polymorphism as a risk for Rheumatoid Arthritis. Rheumatology International. 26:749-751, 2006